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高浓度的盐溶液必赢国际官网

点击:163 更新时间:2019-01-16 09:33:19



     

(Phenol)对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但是水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液(比如4M必赢国际官网),离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收;还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加,其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收。



回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入2倍体积的乙醇,在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到-20,时间一长反而会导致大量盐的沉淀,这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收,所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子,因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀,就用70%的乙醇多洗几次,每次在室温放置一个小时以上,并用tip将沉淀打碎,就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase(50 ug/ml)TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA,多数情况下你能看到三条带,但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。



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